Desafíos y avances recientes en el descubrimiento de fármacos para enfermedades tropicales
Hay muy pocas dianas de fármacos moleculares bien validadas para enfermedades tropicales, en parte debido a una falta de comprensión de la biología detallada de muchos de los patógenos. Por ejemplo, las funciones de muchas proteínas son desconocidas, o solo se han deducido de otros organismos. Para ayudar a seleccionar objetivos apropiados incluyen esencialidad, capacidad de tratamiento, la capacidad de ensayo y la oportunidad de selectividad sobre los ortólogos del huésped. La deficiencia de herramientas genéticas para muchos organismos relevantes para enfermedades es una razón clave por la que hay tan pocos datos de esencialidad disponibles. Sin embargo, nuevo las tecnologías están surgiendo, incluyendo CRISPR – Cas9, que ofrece la posibilidad de aumentar notablemente el número de objetivos validados disponibles en un futuro próximo.
Referencia:
De Rycker M, Baragaña B, Duce S. L, & Gilbert I. H. Challenges and recent progress in drug discovery for tropical diseases. Nature. 2018;559(7715): 498–506. doi:10.1038/s41586-018-0327-4 Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41586-018-0327-4
Los macrófagos promueven la proliferación epitelial después de una lesión pulmonar infecciosa y no infecciosa a través de un mecanismo dependiente del factor 2 de Trébol.
Los
esfuerzos coordinados entre macrófagos y epitelios se consideran esenciales
para la curación de heridas. Los macrófagos del pulmón dependen del factor 2 de Trébol para promover la
proliferación epitelial después del daño causado por heridas estériles, Nippostrongylusbrasiliensis o sulfato de bleomicina. Inesperadamente, la
presencia de poblaciones de T, B o ILC no fue esencial para la reparación
impulsada por macrófagos. En cambio, la eliminación condicional de TFF2
en ratones flox CD11c CreTFF2
con restricción mieloide exacerbó la patología pulmonar y redujo la
expansión proliferativa de CD45 - EpCAM + pro-SPC +Células
alveolares tipo 2. Los macrófagos deficientes en TFF2 redujeron la
expresión de los genes Wnt4 y Wnt16 de Wnt, y
la reconstitución de ratones flox de Cre TFF2
de CD11c Cre TFF2 infectados con
anquilostomas con rWnt4 y rWnt16 restauró el defecto proliferativo en el
epitelio pulmonar después de la lesión. Referencia:
Hung L.-Y, Sen D, Oniskey T, Katzen J, Cohen N, Vaughan A,et al. Macrophages promote epithelial proliferation following infectious and non-infectious lung injury through a Trefoil factor 2-dependent mechanism. Mucosal Immunology.2018. Disponible en:https://www.nature.com/articles/s41385-018-0096-2
Na-APR-1 (M74) es una proteasa aspártica que se vuelve enzimáticamente inactiva por mutagénesis dirigida al sitio y es un componente antígeno candidato en la Vacuna contra el Anquilostoma Humano. La proteasa mutante ejerce la eficacia de la vacuna al inducir anticuerpos que neutralizan la actividad enzimática de la enzima de tipo salvaje (Na-APR-1wt) en el intestino del anquilostoma, privando así al gusano de su capacidad para digerir su comida de sangre. La versión mutada, Na-APR-1 (M74), luego se expresó al nivel de GMPc usando un sistema de expresión Nicotiana benthamiana (Fraunhofer, CMB, Delaware, MD), formulado con Alhydrogel, y se usó para inmunizar ratones en un estudio de rango de dosis para explorar la capacidad neutralizadora de enzimas de la IgG anti-Na-APR-1 (M74) resultante. Tan poco como 0,99 μg de Na-APR-1 (M74) recombinante podrían inducir IgG anti Na-APR-1 (M74) en ratones que eran capaces de inhibir la digestión mediada por Na-APR-1w de un sustrato peptídico en un 89%.
Imagen: Evaluación de la interacción de unión de Na-APR-1 y pepstatina A. Modelos de pepstatina A acoplados dentro del sitio activo de (A) Na-APR-1 wt o (B) Na-APR-1M74 se modelaron en catepsina D humana complejada con pepstatina A usando MODELLER 23, 24. En cada modelo, se muestra pepstatina A (azul) que interactúa con las cadenas laterales de aminoácidos que recubren el bolsillo de unión (magenta).
Ventajas y desventajas
Ventajas
Determinar partes de génes endógenos para identificar como altera el mecanismo molecular del huésped.
Aplicación de vacunas con modelos animales para identificar los resultados del estudio.
Innovar nuevos productos que pueden mejorar la calidad de vida y la intensidad de la enfermedad.
Realizar en un futuro terapia génica
Lograr un mecanismo de prevención contra la enfermedad a través de las vacunas inmunoresistentes.
Desventajas
Utilizar tecnologías biológicas y agentes patógenos para propagarlos entre la población. (bioterrorismo)
Provocar una reacción alérgica para el huésped, debido a que no se sabe como puede reaccionar cada individuo al transgénico.
Provocar una resistencia si se administra de manera inconsciente la vacuna con material transgénico.
Provocar un monopolio u oligopolio, es decir una lucración excesiva por el material obtenido en el estudio.
Contaminación genética, es decir,flujo genético no controlado hacia una población salvaje.
Referencias:
Pearson S, Jariwala R, Abbenante G, Plieskatt J, Wilson D, Bottazzi E, Loukas A. New tools for NTD vaccines: A case study of quality control assays for product development of the human hookworm vaccineNa-APR-1M74. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 2015;11(5): 1251–1257. Disponible en:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26018444
El gen Ace-mtp-2 codifica una metaloproteasa similar a la astascina, con una masa molecular teórica de 26,7 kDa. La proteasa tiene un péptido señal putativo, 11 sitios potenciales de fosforilación y dos puentes disulfuro revelados por análisis computacional. La expresión máxima de Ace-mtp-2 por A. ceylanicum ocurre en la etapa adulta del parásito, y la transferencia de Western indica la naturaleza secretora de la proteasa. Esto sugiere que la proteasa está funcionando en la interfaz huésped-parásito y probablemente estaría expuesta a la respuesta inmune del huésped. Recombinante Ace-MTP-2 amplificó la liberación in vitro de TNFα y la liberación inducida de IFNγ por macrófagos THP-1 activados por lipopolisacáridos.
ADN recombinante artificial
Se clonó un ADNc que codifica la metaloproteasa 6 de Ancylostoma ceylanicum (Acemep-6). Ace-MEP-6 es una proteína con una masa molecular prevista de 101.87 kDa y, según el análisis computacional, es muy probable que se involucre en el procesamiento de alimentos a través de la digestión con hemoglobina. Se inmunizaron grupos de hámsters con una vacuna de cDNA Ace-mep-6, una o tres veces. Los animales a los que se les administró una dosis desarrollaron alta resistencia (80%, p < 0.01) contra la infección de desafío, mientras que la inmunización triple no produjo una reducción de la carga de gusanos.
Referencias:
Bąska P, Wiśniewski M, Krzyżowska M, Długosz E, Zygner W, Górski P, & Wędrychowicz H. Molecular cloning and characterisation of in vitro immune response against astacin-like metalloprotease Ace-MTP-2 from Ancylostoma ceylanicum. Experimental Parasitology. 2013; 133(4): 472–482. Disponible en:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23376445
Proteína patógena recombinante revela un nuevo mecanismo mediante el cual los anquilostomas suprimen la señalización del receptor de células B.
Na-ASP-2 es un eficaz antígeno de la vacuna contra las anquilostomas. Sin embargo, a pesar de la elucidación de su estructura cristalina y los estudios que abordan su inmunobiología, la función de Na-ASP-2 sigue siendo difícil de alcanzar. A través de un microarray de proteoma humano de 9000 proteínas con Na-ASP-2 se mostró unión a CD79A, un componente del complejo receptor de antígeno de células B. Na-ASP-2 se unió a linfocitos B humanos ex vivo y regulaba a la baja la transcripción de aproximadamente 1000 ARN mensajeros de células B (ARNm), mientras que solo aproximadamente 100 ARNm estaban regulados al alza, en comparación con las células tratadas con control.
Imagen: Unión de Na-ASP-2 biotinilado a CD79A y proteínas de unión a biotina en un ProtoArray V5 humano. La matriz se probó con Na-ASP-2 recombinante biotinilado seguido de estreptavidina Alexa Fluor 647 y se exploró con un escáner GeneArray 4000B a 635 nm, usando los ajustes de intensidad del láser de 100% (A) y 66% (B). Los cuadros amarillos indican el área de la matriz que contiene puntos duplicados de CD79A y PCCA. Una vista ampliada del área contenida. Dentro de las casillas amarillas también se muestra (C). Todos los demás puntos son proteínas de control positivo manchadas por duplicado para permitir la orientación en la matriz. Dos separadas las matrices se sondearon independientemente, con resultados representativos de 1 experimento mostrado.
Referencias:
Tribolet L, Cantacessi C, Pickering A, Navarro S, Doolan L, Trieu A, & Loukas, A. Probing of a Human Proteome Microarray With a Recombinant Pathogen Protein Reveals a Novel Mechanism by Which Hookworms Suppress B-Cell Receptor Signaling. Journal of Infectious Diseases. 2014; 211(3): 416–425. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25139017
T: Un nuevo ensayo de PCR en tiempo real, específico de especie, para la detección del parásito zoonótico emergente Ancylostoma ceylanicum y duodenale en heces humanas.
O:Determinar un elemento de ADN genómico altamente repetitivo y no codificante basado en PCR en tiempo real para la detección de A. ceylanicum y duodenale.
M: muestras de heces humanas infectadas por A ceylanicum y A. duodenale
Sensibilidad y especificidad analítica: No tiene, solo clínica
Referencias:
Papaiakovou M, Pilotte N, Grant JR, Traub RJ, Llewellyn S, McCarthy JS, et al. A novel, species-specific, real-time PCR assay for the detection of the emerging zoonotic parasite Ancylostoma ceylanicum in human stool. PLoS Negl Trop Dis. 2017; 11(7): e0005734.bn Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28692668
La PCR basada en el sistema de mutación refractaria de amplificación (tetraprimer ARMS-PCR) es una herramienta muy útil para el análisis de SNP. Esta técnica utiliza cuatro cebadores, dos externos y dos internos, en la misma reacción, un cebador para reconocer al ADN no mutado y un cebador para reconocer al ADN mutado, en este caso el objetivo fue estandarizar una herramienta molecular basada en el tetraprímero ARMS-PCR y realizar una selección del SNP E198A en el gen de isotipo 1 de tubulina. Los cebadores empleados en este estudio se diseñaron utilizando el programa Oligo Explorer 1.4 (Gene link, EE. UU.) Según la secuencia disponible en la base de datos NCBI (número de acceso de GenBank DQ459314).
La Tabla 1 enumera las secuencias del cebador, las temperaturas de recocido y la posición de la base que se modificó.
Para estandarizar esta técnica molecular, primero sintetizamos controles para la presencia y ausencia de la mutación. Para sintetizar el control negativo para el alelo mutado en el codón 198 (TubE), se realizó una amplificación por PCR inicial con los cebadores Fa198 y Ra198 (588 pb) utilizando ADN genómico de A. duodenale . A continuación, se realizó una PCR anidada utilizando los cebadores Fb198 y Rb198 (331 pb) y el fragmento obtenido. Fue secuenciado para confirmar la ausencia de una mutación. Para sintetizar el control positivo mutado (TubA), se realizó una mutagénesis dirigida utilizando la técnica Megaprimer-PCR.
Referencias:
Furtado L, Alves W, Moreira T, Costa Junior L, Miranda R y Rabelo E. Standardization and application of the tetraprimer ARMS-PCR technique for screening of the E198A SNP in the -tubulin gene of hookworm populations in Brazil. Elsevier. 2016; 224: 65–67 Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27270392
Wei K, Yan Q, Tang B, Yang S, Zhang P, Deng M, Lü M. Hookworm Infection: A Neglected Cause of Overt Obscure Gastrointestinal Bleeding. The Korean Journal of Parasitology. 2017; 55(4): 391-398. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28877570
