Prueba de tamizaje
La PCR basada en el sistema de mutación refractaria de amplificación (tetraprimer ARMS-PCR) es una herramienta muy útil para el análisis de SNP. Esta técnica utiliza cuatro cebadores, dos externos y dos internos, en la misma reacción, un cebador para reconocer al ADN no mutado y un cebador para reconocer al ADN mutado, en este caso el objetivo fue estandarizar una herramienta molecular basada en el tetraprímero ARMS-PCR y realizar una selección del SNP E198A en el gen de isotipo 1 de tubulina. Los cebadores empleados en este estudio se diseñaron utilizando el programa Oligo Explorer 1.4 (Gene link, EE. UU.) Según la secuencia disponible en la base de datos NCBI (número de acceso de GenBank DQ459314).
La Tabla 1 enumera las secuencias del cebador, las temperaturas de recocido y la posición de la base que se modificó.
Para estandarizar esta técnica molecular, primero sintetizamos controles para la presencia y ausencia de la mutación. Para sintetizar el control negativo para el alelo mutado en el codón 198 (TubE), se realizó una amplificación por PCR inicial con los cebadores Fa198 y Ra198 (588 pb) utilizando ADN genómico de A. duodenale . A continuación, se realizó una PCR anidada utilizando los cebadores Fb198 y Rb198 (331 pb) y el fragmento obtenido. Fue secuenciado para confirmar la ausencia de una mutación. Para sintetizar el control positivo mutado (TubA), se realizó una mutagénesis dirigida utilizando la técnica Megaprimer-PCR.
Referencias:
- Furtado L, Alves W, Moreira T, Costa Junior L, Miranda R y Rabelo E. Standardization and application of the tetraprimer ARMS-PCR technique for screening of the E198A SNP in the -tubulin gene of hookworm populations in Brazil. Elsevier. 2016; 224: 65–67 Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27270392
- Wei K, Yan Q, Tang B, Yang S, Zhang P, Deng M, Lü M. Hookworm Infection: A Neglected Cause of Overt Obscure Gastrointestinal Bleeding. The Korean Journal of Parasitology. 2017; 55(4): 391-398. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28877570
3 comentarios:
¿Existe la posibilidad de que la plantilla de ADN y/o sus cebadores ( Fa198 y Ra198 (588 pb), (331 pb)) de PCR se degraden después de su primer uso, creando bandas no específicas con el producto de PCR, dando como resultado la detección erronea del ADN mutado y no mutado?
¿cual seria otra prueba de tamizaje que seria muy util para la detención de uncinarias aparte de la PCR ?
Porque crees que la detección de uncinarias por la técnica de PCR, supera a otras técnicas convencionales directas para el diagnóstico o confirmación de esta y otras parasitosis en pacientes infectados; como: copros parasitarios, pruebas de sangre, cultivos, métodos de concentración, etc?
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