ADN RECOMBINANTE

ADN recombinante en la naturaleza

El gen Ace-mtp-2 codifica una metaloproteasa similar a la astascina, con una masa molecular teórica de 26,7 kDa. La proteasa tiene un péptido señal putativo, 11 sitios potenciales de fosforilación y dos puentes disulfuro revelados por análisis computacional. La expresión máxima de Ace-mtp-2 por A. ceylanicum ocurre en la etapa adulta del parásito, y la transferencia de Western indica la naturaleza secretora de la proteasa. Esto sugiere que la proteasa está funcionando en la interfaz huésped-parásito y probablemente estaría expuesta a la respuesta inmune del huésped. Recombinante Ace-MTP-2 amplificó la liberación in vitro de TNFα y la liberación inducida de IFNγ por macrófagos THP-1 activados por lipopolisacáridos.

ADN recombinante artificial

Se clonó un ADNc que codifica la metaloproteasa 6 de Ancylostoma ceylanicum (Acemep-6). Ace-MEP-6 es una proteína con una masa molecular prevista de 101.87 kDa y, según el análisis computacional, es muy probable que se involucre en el procesamiento de alimentos a través de la digestión con hemoglobina. Se inmunizaron grupos de hámsters con una vacuna de cDNA Ace-mep-6, una o tres veces. Los animales a los que se les administró una dosis desarrollaron alta resistencia (80%, p < 0.01) contra la infección de desafío, mientras que la inmunización triple no produjo una reducción de la carga de gusanos.

Referencias:

1. Bąska P, Wiśniewski M, Krzyżowska M, Długosz E, Zygner W, Górski P, & Wędrychowicz H. Molecular cloning and characterisation of in vitro immune response against astacin-like metalloprotease Ace-MTP-2 from Ancylostoma ceylanicum. Experimental Parasitology. 2013; 133(4): 472–482. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23376445 
2. Wiśniewski M, Jaros S, Bąska P, Cappello M, & Wędrychowicz, H. Ancylostoma ceylanicum metalloprotease 6 DNA vaccination induces partial protection against hookworm challenge infection. Acta Parasitologica. 2013; 58(3): 376–383. Disponible en: https://www.degruyter.com/view/j/ap.2013.58.issue-3/s11686-013-0151-9/s11686-013-0151-9.xml  

MICROARRAY

Proteína patógena recombinante revela un nuevo mecanismo mediante el cual los anquilostomas suprimen la señalización del receptor de células B.

Na-ASP-2 es un eficaz antígeno de la vacuna contra las anquilostomas. Sin embargo, a pesar de la elucidación de su estructura cristalina y los estudios que abordan su inmunobiología, la función de Na-ASP-2 sigue siendo difícil de alcanzar. A través de un microarray de proteoma humano de 9000 proteínas con Na-ASP-2 se mostró unión a CD79A, un componente del complejo receptor de antígeno de células B. Na-ASP-2 se unió a linfocitos B humanos ex vivo y regulaba a la baja la transcripción de aproximadamente 1000 ARN mensajeros de células B (ARNm), mientras que solo aproximadamente 100 ARNm estaban regulados al alza, en comparación con las células tratadas con control. 

Imagen: Unión de Na-ASP-2 biotinilado a CD79A y proteínas de unión a biotina en un ProtoArray V5 humano. La matriz se probó con Na-ASP-2 recombinante biotinilado seguido de estreptavidina Alexa Fluor 647 y se exploró con un escáner GeneArray 4000B a 635 nm, usando los ajustes de intensidad del láser de 100% (A) y 66% (B). Los cuadros amarillos indican el área de la matriz que contiene puntos duplicados de CD79A y PCCA. Una vista ampliada del área contenida. Dentro de las casillas amarillas también se muestra (C). Todos los demás puntos son proteínas de control positivo manchadas por duplicado para permitir la orientación en la matriz. Dos separadas las matrices se sondearon independientemente, con resultados representativos de 1 experimento mostrado.

Referencias:

1. Tribolet L, Cantacessi C, Pickering A, Navarro S, Doolan L, Trieu A, & Loukas, A. Probing of a Human Proteome Microarray With a Recombinant Pathogen Protein Reveals a Novel Mechanism by Which Hookworms Suppress B-Cell Receptor Signaling. Journal of Infectious Diseases. 2014; 211(3): 416–425. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25139017

PRUEBA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERA

T:  Un nuevo ensayo de PCR en tiempo real, específico de especie, para la detección del parásito zoonótico emergente Ancylostoma ceylanicum y duodenale en heces humanas.

O: Determinar un elemento de ADN genómico altamente repetitivo y no codificante basado en PCR en tiempo real para la detección de A. ceylanicum y duodenale.

M: muestras de heces humanas infectadas por A ceylanicum y A. duodenale

AN: DNA de A. duodenale y A. ceylanicum.

G: 

Gen         Pares de base

ITS-2       64bp

EXT:

L: Shock térmico
S: Centrifugado
P: Cromatografía

PCR: real-time PCR  

Pasos

 Ciclos       Temperatura           Tiempo

                      95 ° C               15 segundos

   40               59 ° C               60 segundos

                      59 ° C               60 segundos

V: EPO (Gel agarosa)

Sensibilidad y especificidad analítica: No tiene, solo clínica

Referencias:

1. Papaiakovou M, Pilotte N, Grant JR, Traub RJ, Llewellyn S, McCarthy JS, et al. A novel, species-specific, real-time PCR assay for the detection of the emerging zoonotic parasite Ancylostoma ceylanicum in human stool. PLoS Negl Trop Dis. 2017; 11(7): e0005734.bn Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28692668                    

PRUEBA DE TAMIZAJE Y CONFIRMATORIA PARA LA DETECCIÓN DE UNCINARIAS

Prueba de tamizaje 

La PCR basada en el sistema de mutación refractaria de amplificación (tetraprimer ARMS-PCR) es una herramienta muy útil para el análisis de SNP. Esta técnica utiliza cuatro cebadores, dos externos y dos internos, en la misma reacción, un cebador para reconocer al ADN no mutado y un cebador para reconocer al ADN mutado, en este caso el objetivo fue estandarizar una herramienta molecular basada en el tetraprímero ARMS-PCR y realizar una selección del SNP E198A en el gen de isotipo 1 de tubulina. Los cebadores empleados en este estudio se diseñaron utilizando el programa Oligo Explorer 1.4 (Gene link, EE. UU.) Según la secuencia disponible en la base de datos NCBI (número de acceso de GenBank DQ459314).  

La Tabla 1 enumera las secuencias del cebador, las temperaturas de recocido y la posición de la base que se modificó. 

Para estandarizar esta técnica molecular, primero sintetizamos controles para la presencia y ausencia de la mutación. Para sintetizar el control negativo para el alelo mutado en el codón 198 (TubE), se realizó una amplificación por PCR inicial con los cebadores Fa198 y Ra198 (588 pb) utilizando ADN genómico de A. duodenale . A continuación, se realizó una PCR anidada utilizando los cebadores Fb198 y Rb198 (331 pb) y el fragmento obtenido. Fue secuenciado para confirmar la ausencia de una mutación. Para sintetizar el control positivo mutado (TubA), se realizó una mutagénesis dirigida utilizando la técnica Megaprimer-PCR. 

Referencias:

1. Furtado L, Alves W, Moreira T, Costa Junior L, Miranda R y Rabelo E. Standardization and application of the tetraprimer ARMS-PCR technique for screening of the E198A SNP in the -tubulin gene of hookworm populations in Brazil. Elsevier. 2016; 224: 65–67 Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27270392
2. Wei K, Yan Q, Tang B, Yang S, Zhang P, Deng M, Lü M. Hookworm Infection: A Neglected Cause of Overt Obscure Gastrointestinal Bleeding. The Korean Journal of Parasitology. 2017; 55(4): 391-398. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28877570